Zakład Biochemii Analitycznej

BacSp222 to niedawno odkryta w naszym zespole bakteriocyna peptydowa produkowana przez oportunistyczny patogen zwierząt domowych Staphylococcus pseudintermedius szczep 222. Bakteriocyna ta zabija szeroką gamę bakterii Gram-dodatnich, umożliwiając komórkom producenta wyeliminowanie konkurencyjnych szczepów bakteryjnych, bytujących w tej samej niszy fizjologicznej organizmu zainfekowanego  gospodarza. Dotychczasowe badania nad BacSp222 koncentrowały się głównie na biologii molekularnej peptydu, na fizykochemicznym mechanizmie jego działania wobec błon bakteryjnych, a także na określeniu struktury peptydu techniką jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR). Tym niemniej najbardziej intrygujące okazały się wyniki dowodzące, że opisana bakteriocyna nie tylko jest zdolna do zabijania bakterii, ale także wykazuje istotną aktywność wobec komórek organizmu gospodarza. Przy wyższych dawkach peptyd działa bowiem cytotoksycznie, natomiast przy stężeniach bardzo małych (nanomole/l) działa jako immunomodulacyjny czynnik prozapalny, indukując w modelowych makrofagowych liniach komórkowych aktywność syntazy tlenku azotu (iNOs) oraz stymulując wydzielanie TNF. Drugie intrygujące odkrycie wykazało, iż bakteriocyna BacSp222 jest produkowana i wydzielana wraz z kilkoma potranslacyjnie modyfikowanymi izoformami, zidentyfikowanych jako pochodne kwasu bursztynowego. W odniesieniu do tych wstępnych wyników, przedstawiony projekt poświęcony jest szeroko zakrojonym badaniom nad immunomodulacyjnym działaniem bakteriocyny na komórki eukariotyczne, nad identyfikacją receptorów komórkowych oraz ewentualnych cytokin zaangażowanych w to zjawisko, a także nad mechanizmem powstawania wspomnianych modyfikacji potranslacyjnych, ich wpływem na aktywność biologiczną bakteriocyny oraz strukturę jej cząsteczki. 

Kompleksowe badania nad aktywnością immunomodulacyjną bakteriocyny BacSp222 będą prowadzone z wykorzystaniem modelowych linii komórkowych oraz komórek pierwotnych. Do badań będzie stosowana bakteriocyna natywna oraz po usunięciu N-końcowej formylo-metioniny - celem weryfikacji wpływu formylacji na rozpoznanie przez określone receptory. Analiza cytokin lub czynników wzrostowych wytwarzanych przez komórki po ekspozycji na bakteriocynę zostanie przeprowadzona przy użyciu platformy LUMINEX, badania nad indukcją iNOs będą prowadzone poprzez bezpośrednie pomiary aktywności enzymu w komórkach, jak i też w oparciu o pomiary ekspresji genu enzymu metodą RT-PCR. Identyfikacja receptorów komórkowych zaangażowanych w rozpoznanie bakteriocyny będzie przeprowadzana z wykorzystaniem ko-stymulacji komórek poprzez bakteriocynę oraz specyficzne dla receptorów związki antagonistyczne, poprzez pomiary wydzielania określonych cytokin, poprzez pomiary wewnątrzkomórkowej mobilizacji cAMP lub Ca⁺² oraz/lub przy użyciu zmodyfikowanych linii komórkowych, eksponujących określone komórkowe receptory rekombinowane. Oznaczenia wpływu bakteriocyny na czynniki transkrypcyjne (np. AP-1, NFκB) będą wykonywane przy użyciu elektroforetycznej techniki EMSA. Wpływ bakteriocyny na morfologię komórek oraz weryfikacja internalizacji bakteriocyny do ich wnętrza będą badane za pomocą mikroskopii konfokalnej, znakowanego fluorescencyjnie peptydu i/lub technikami immunochemicznymi. Badania dotyczące potranslacyjnej regulacji aktywności biologicznej bakteriocyny będą prowadzone z wykorzystaniem zmodyfikowanych izoform peptydu wyizolowanych z pożywki pohodowlanej. Wpływ bursztynylacji na strukturę peptydu w roztworze będzie określany techniką NMR, właściwości biologiczne izoform będą określane za pomocą testów aktywności bakteriobójczej i cytotoksycznej, a także za pomocą opisanych wyżej technik badawczych z zakresu biochemii komórki. Mechanizm obróbki potranslacyjnej bakteriocyny oraz wpływ czynników środowiskowych na to zjawisko będzie badany technikami chromatograficznymi.

Pod względem biologicznym bakteriocyny definiuje się jako peptydy lub białka wytwarzane przez bakterie na rybosomach, zdolne do zabijania blisko spokrewnionych szczepów żyjących w tej samej niszy fizjologicznej lub ekologicznej. Cząsteczki te pełnią również rolę regulatorów metabolizmu zależnych od gęstości populacji lub obecności innych bakterii. Szacuje się, że 99% szczepów bakterii wytwarza co najmniej jedną bakteriocynę, tak więc biologiczne i ekologiczne znaczenie tych czynników jest ogromne. Ponadto, bakteriocyny lub też mikroorganizmy produkujące bakteriocyny są szeroko stosowane w przemyśle spożywczym, produkcji pasz, w weterynarii i medycynie. Realizacja badań przedstawionych w niniejszym projekcie pozwoli przede wszystkim określić, czy bakteriocyny produkowane przez oportunistyczne patogeny mogą także odgrywać rolę czynników wirulencji, zdolnych do modulowania aktywności komórek odpornościowych zainfekowanego organizmu. Dodatkowo, pozwoli także na zbadanie nowego potranslacyjnego mechanizmu regulacji aktywności biologicznego bakteriocyn, opartego na bursztynylacji łańcucha polipeptydowego.

„Badania roli układów toksyna-antytoksyna w antybiotykooporności gronkowców”

Gronkowce (łac. Staphylococcus) są bakteriami stanowiącymi naturalną mikroflorę skóry i błon śluzowych ludzi i zwierząt ciepłokrwistych. Z drugiej strony są one niebezpiecznymi oportunistycznymi patogenami mogącymi wywołać szereg schorzeń u swoich gospodarzy. Wspomniane zagrożenie potęgowane jest dodatkowo przez rosnącą lekooporność tych bakterii co powoduje wymierne trudności w terapii zakażeń gronkowcowych.

Układy toksyna-antytoksyna (TA) występują powszechnie u bakterii lecz nie u organizmów eukariotycznych. Składają się one z ‘toksyny’, wewnątrzkomórkowego białka często o właściwościach enzymatycznych, i ‘antytoksyny’ będącej jej specyficznym inhibitorem. W wyniku aktywacji systemu następuje uwolnienie toksyny co prowadzi do „zatrucia” komórki skutkującego między innymi zahamowaniem wzrostu lub nawet jej śmiercią. Choć rola układów TA w fizjologii bakterii jest ciągle przedmiotem burzliwej dyskusji, wiadomo że systemy te zaangażowane są w stabilizację materiału genetycznego oraz odpowiedź na stres wywołany między innymi obecnością antybiotyków. Badania wstępne wykazały, że u gronkowców geny układów TA występują często wspólnie z genami oporności na antybiotyki.

W ramach niniejszego projektu planujemy poznać powiązanie występowania układów TA u gronkowców z ich antybiotykoopornością. Badania skupiać się będą nad wyjaśnieniem czy i jak układy TA wpływają na pozyskiwanie i stabilizację materiału genetycznego kodującego oporność na antybiotyki. Ponadto zamierzamy zbadać w jaki sposób aktywacja układu prowadząca do uwolnienia aktywności enzymatycznej toksyny (RNaza) reguluje stopień podatności bakterii gronkowca na wybrane antybiotyki.

Realizacja projektu wymaga zastosowania szeregu technik z dziedziny bakteriologii, biologii molekularnej i biochemii. Między innymi przeszukiwane będą bazy danych z wykorzystaniem specjalistycznego oprogramowania. Do funkcjonalnej charakterystyki nowoodkrytych układów TA zastosowane zostaną techniki chromatograficzne i elektroforetyczne. Za pomocą specjalistycznej aparatury badany też będzie wpływ układów TA i antybiotyków na bakterie.

Badania wpływu układów TA na lekooporność gronkowców wpisują się w najnowsze trendy badań współczesnej bakteriologii. Jest to szczególnie istotne w przypadku gronkowców, oportunistycznych patogenów, gdyż bakterie te są przyczyną wielu groźnych infekcji u ludzi i zwierząt powodującymi szereg niebezpiecznych schorzeń prowadzących do zagrożenia zdrowia publicznego i ogromnych strat w hodowli zwierząt. Poznawanie powiązań i mechanizmów łączących systemy TA z opornością bakterii na antybiotyki niewątpliwie poszerzy naszą wiedzę z dziedziny współczesnej bakteriologii z przyszłymi korzyściami dla praktyki lekarskiej i weterynaryjnej. Ponadto, planowane badania wychodzą naprzeciw palącemu problemowi rosnącej lekooporności bakterii, o rozwiązanie którego apelują instytucje i organizacje krajowe i międzynarodowe.

„Systemy toksyna-antytoksyna jako regulatory ekspresji genów u gronkowców”

Gronkowce są bakteriami stanowiącymi naturalną mikroflorę skóry i błon śluzowych ludzi i zwierząt ciepłokrwistych. Z drugiej strony są one niebezpiecznymi oportunistycznymi patogenami mogącymi wywołać szereg schorzeń u swoich gospodarzy. Wspomniane zagrożenie potęgowane jest dodatkowo przez rosnącą lekooporność i wirulencję szczepów gronkowcowych związaną z transferem materiału genetycznego kodującego czynniki odpowiedzialne za powyższe właściwości. Układy toksyna-antytoksyna (TA) występują powszechnie u bakterii. Składają się one z ‘toksyny’, która często jest specyficzną wobec danej sekwencji endorybonukleazą i z ‘antytoksyny’ będącej dedykowanym inhibitorem ‘toksyny’. Analiza doniesień literaturowych w połączeniu z bardzo interesującymi naszymi wynikami wstępnymi dotyczącymi charakterystyki układu TA (PemIKSa) występującego u Staphylococcus aureus CH91 pozwala nam przypuszczać, że rola systemów TA wykracza poza pierwotnie postulowane zaangażowanie w utrzymanie plazmidów w populacji bakteryjnej sugerując ich zaangażowanie w globalną regulację ekspresji genów, w szczególności kodujących czynniki wirulencji i białka determinujące oddziaływanie bakteria-środowisko.

W ramach niniejszego projektu planujemy poznać powiązanie występowania układów TA u gronkowców z ich wirulencją i zdolnościom do przetrwania ekspozycji na antybiotyki. Ponadto zbadany zostanie molekularny mechanizm aktywacji systemu PemIKSa i powiązny ze zmianami na poziomie transkryptomu i proteomu w celu wykazania roli systemów TA w globalną regulację ekspresji genów.

Realizacja projektu wymaga zastosowania szeregu technik z dziedziny biologii molekularnej, mikrobiologii i technik „omicznych”. W badaniach dystrybucji układów TA w szczepach gronkowcowych wykorzystana zostanie technika PCR, w wersji optymalnej w formie tzw. Multiplex PCR pozwalającej na jednoczesne powielenie kilku różnych fragmentów DNA. Do wyłączania (knock-out) genów zastosowana będzie technika oparta o plazmid pKOR. Natomiast suplementacja szczepów dodatkowymi genami układów TA za pomocą serii plazmidów pCN. Za pomocą technik ilościowego RT-PCR (qRT-PCR) oraz Northern blot określony zostanie poziom transkryptu operonu układu TA oraz innych kluczowych genów w poszczególnych fazach wzrostu bakterii oraz w różnych warunkach stresowych. Zdolność do tworzenia biofilmu określana będzie metodą spektrofotometryczną po barwieniu komórek zaadsorbowanych do płytek polistyrenowych. Zmiany w transkryptomie po aktywacji systemów TA będą badane za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (RNA-seq, Illumina). Badania proteomu przeprowadzone będą techniką bezżelową wykorzystującą znakowanie izobaryczne (iTRAQ) oraz spektrometrię mas.

W wyniku realizacji projektu poszerzona zostanie wiedza na temat roli układów TA w regulacji ekspresji genów u gronkowców na ich wirulencję oraz ściśle z nią związaną zdolność do tworzenia biofilmów i unikania bakteriobójczego działania antybiotyków. Poznawanie molekularnych mechanizmów, mających swoje odzwierciedlenie w traskryptomie i proteomie, które mogą łączyć systemy TA z wirulencją czy opornością na antybiotyki tych bakterii niewątpliwie poszerza naszą wiedzę z dziedziny współczesnej bakteriologii i biologii molekularnej.

Ze względu na istotność prowadzonych badań dla środowiska naukowego i praktyki medycznej otrzymane wyniki zamierzamy opublikować w czasopismach o zasięgu międzynarodowym. Preferowane będą czasopisma o możliwie wysokim indeksie cytowań i bezpłatnym dostępie dla czytelników. Ponadto planowana jest prezentacja wyników na prestiżowych konferencjach naukowych, gdzie istnieje możliwość nawiązania współpracy z badaczami z wiodących ośrodków w temacie badań. Jest to szczególnie istotne, gdyż wykonawcami projektu są także młodzi pracownicy naukowi.

„Badania nad bakteriocynami i czynnikami wirulencji odzwierzęcego szczepu Staphylococcus pseudintermedius 222"

Staphylococcus pseudintermedius to pospolita bakteria bytująca na zwierzętach domowych, szczególnie psach oraz koniach. Ze względu na rosnącą liczbę dowodów, iż bakterie te mogą także przenosić się na ludzi, w projekcie niniejszym podjęto się zbadania peptydowych i białkowych związków, które ułatwiają takim bakteriom infekcje. Były to, w szczególności, bakteriocyny - czyli związki za pomocą których bakterie niszczą blisko spokrewnione szczepy innych bakterii, konkurujące z nimi w jednym siedlisku biologicznym, oraz czynniki wirulencji - czyli białka i peptydy, za pomocą których patogen ułatwia sobie rozprzestrzenianie się w organizmie zainfekowanego gospodarza. Obiektem badań w projekcie był konkretnie szczep Staphylococcus pseudintermedius o oznaczeniu 222 (PCM 2791), pozyskany pierwotnie ze skórnych zmian chorobowych psa, zaś prace dotyczyły ogólnie izolacji oraz biochemicznej, strukturalnej i molekularnej charakterystyki bakteriocyn i czynników wirulencji produkowanych przez tą bakterię i wydzielanych na zewnątrz.

W efekcie przeprowadzonych prac wyizolowano oraz szczegółowo scharakteryzowano pod względem biochemicznym, molekularnym i biologicznym unikatowy peptyd BacSp222, który w nietypowy i rzadki sposób łączy w jednej cząsteczce funkcje bakteriocyny oraz cytotoksycznego i immunomodulującego czynnika wirulencji. Zbadano także strukturę przestrzenną tego peptydu (patrz rysunek niżej), która z jednej strony wykazuje podobieństwa do niektórych znanych już bakteriocyn, a z drugiej, do wybranych domen rożnych białek prokariotycznych i eukariotycznych. Wyizolowano oraz scharakteryzowano także cztery nowe peptydy bioaktywne o roboczych nazwach P1-P4, które pełnią rolę typowych czynników wirulencji. Dwa z tych peptydów pochodzą z rodziny delta-hemolizyn a dwa z rodziny alfa/epsilon-modulin. Wreszcie, wyizolowano oraz scharakteryzowano nowy enzym - lizostafinę Sp222. Pełni on rolę bakteriocyny białkowej z rodziny bakteryjnych enzymów muraminolitycznych, i jest zdolny do lizy ścian wrażliwych komórek bakteryjnych.

W sumie, realizacja projektu pozwoliła na poznanie i scharakteryzowanie szeregu nowych czynników peptydowych i białkowych, za pomocą których odzwierzęcy patogen oportunistyczny eliminuje bakteryjnych konkurentów bytujących w tej samej niszy fizjologicznej, oraz które ułatwiają rozprzestrzenianie się infekcji w organizmie gospodarza. Realizacja projektu otworzyła także nowe pola badań, które wciąż są w toku - nad mechanizmem oddziaływania BacSp222 z membranami, nad mechanizmem immunomodulacyjnych własności BacSp222 wobec komórek linii makrofagowych, nad modyfikacjami potranslacyjnymi BacSp222, a także nad strukturą oraz specyficznością lizostafiny Sp222. Przeprowadzone oraz planowane badania mogą także mieć potencjał komercjalizacyjny i dotyczy to w szczególności wspomnianego bakteriobójczego i immunomodulacyjnego peptydu BacSp222 oraz litycznego enzymu - lizostafiny Sp222.

„Identyfikacja i badania czynników wpływających na wirulencję gronkowców z wykorzystaniem genomiki i proteomiki"

Oddziaływanie bakterii patogennych na organizm gospodarza zachodzi poprzez tak zwane czynniki wirulencji, które mogą być zlokalizowane na powierzchni komórek mikroorganizmu lub wydzielane na zewnątrz. Geny czynników zaangażowanych w wirulencję, ich ekspresja i kontrola podlegają układom zlokalizowanym wewnątrz komórki i dopiero skoordynowane działanie tych elementów prowadzi do obserwowanego fenotypu i przekłada się na wymierny efekt biologiczny.

W ramach niniejszego projektu zamierzamy zbadać korelację pomiędzy genotypem, fenotypem oraz proteomem a wirulencją starannie dobranych szczepów gronkowców, w celu identyfikacji i charakterystyki czynników wpływających na obserwowany efekt biologiczny (zdolność do efektywnej kolonizacji gospodarza i wywołania infekcji).

Przedmiotem badań będą staranie dobrane szczepy S. aureus (komensalne oraz ze zmian chorobowych) izolowane od ludzi i zwierząt (drobiu). Realizacja projektu składała się będzie z dwóch podstawowych części, genomicznej i proteomicznej. Część genomiczna, dotyczyć będzie poznania sekwencji genomu wybranych szczepów S. aureus przy użyciu technik „next generation sequencing" (platforma Ilumina). Drugą część badań genomicznych będzie stanowiła bioinformatyczna analiza otrzymanych wyników. Dla osiągnięcia zamierzonych celów tego typu wysokoprzepustowych badań planowane jest wykorzystanie ogólnodostępnych baz danych i programów komputerowych oraz stworzenie własnych dedykowanych skryptów w języku Python.

Badania proteomu zewnątrzkomórkowego oraz zasocjowanego z powierzchnią komórki (dla wybranych szczepów S. aureus) będą miały na celu powiązanie danych genomowych z pulą białek mogących potencjalnie oddziaływać z gospodarzem podczas kolonizacji i infekcji. Analizy te będą przebiegały dwutorowo. W pierwszej kolejności porównane zostaną proteomy (zewnątrzkomórkowe) wybranych szczepów charakteryzujących się wysoką i niską wirulencją w modelu zarodków kurzych. Wykorzystana tu zostanie technika 2D DIGE oparta na jednoczesnej analizie dwóch próbek wyznakowanych różnymi barwnikami fluorescencyjnymi. Drugi kierunek badań proteomicznych będzie dotyczył białek związanych z powierzchnią komórek bakterii. Do analizy tej puli białek zastosowana zostanie tak zwana technika „golenia" (ang. shaving) komórki.